의협 조승국 공보이사, 조국교수 딸 제1저자 논문 한글 번역

의협 조승국 공보이사(내과 전문의)가 최근 이슈가 되고 있는 조국교수 딸의 제1저자 논문을 한글로 번역해서 자신의 facebook에 공개 하였습니다. 

조 이사는 자신의 페이스북에 공개한 글에서 이번 조국 후보자 딸 사태를 지켜보면서 "이 논문의 '실체'를 이해하려는 노력이 부족하지 않나 하는 점 때문에 아쉬운 생각이 들었다"며 논문을 번역하게 되었다고 합니다. 

[주산기 저산소성 허혈성 뇌병증에서 eNOS 유전자 다형성]

배경 : 주산기 저산소성 허혈성 뇌병증(HIE)에서 뇌혈류는 저하되고 산화 질소 합성효소(NOS)의 활성은 현저히 증가한다. 내피 NOS(eNOS) 다형성은 뇌졸중 발생의 연관 인자로 잘 알려져 있다.

방법 : 주산기 HIE(HIE 군)가 있는 37 명의 만삭아/준 만삭아와 주산기에 문제가 없는 54명의 정상 만삭아(대조군)에서 제한 단편 효소 소화를 사용하거나 사용하지 않은 중합 효소 연쇄 반응(polymerase chain reaction, 이하 PCR)을 시행하여 eNOS 유전자와 임상적으로 관련 있는 유전자 다형성 3가지를 판별하였다. 두 군 간의 유전자형(genotype), 대립 유전자(allele) 및 하플로타입(haplotype) 빈도의 차이를 평가하였다.

결과 : 대립 유전자의 빈도 분석 결과 Glu298Asp의 G 대립 유전자가 대조군보다 HIE 그룹에서 더 빈번하였다. 대조군 및 HIE와 동반하여 발생한 합병증을 갖는 각 하위 군을 비교한 결과 T-786C의 TC 유전자형 및 C 대립 유전자가 신생아 지속적 폐고혈압증(persistent pulmonary hypertension of the newborn, 이하 PPHN) 환자에서 대조군보다 더 흔하였다. A b T 하플로타입의 빈도는 대조군보다 HIE 환자에서 더 낮았다.

결론: Glu298Asp의 G 대립 유전자는 주산기 HIE와 관련이 있었으며, T-786C의 TC 유전자형과 C 대립 유전자는 PPHN과 관련이 있었다.

▷서론

산화 질소(NO) 는 NO 합성효소(NOS)에 의해 L- 아르기닌이 L- 시트룰린으로 산화되어 생성된다. 내피 세포는 내피 NOS(eNOS)를 통해 NO를 생성할 수 있는데, 이는 혈관 긴장도를 조절하는 데 중요한 생리학적 역할을 한다. 또한, NO는 평활근 세포 증식을 조절하고, 내피에 대한 백혈구 부착 및 혈소판 응집의 억제를 약화시킨다.

NO는 많은 인간 심혈관질환 발병에서 중요한 역할을 한다. 기저 NO의 생성 감소 및 활성 저하는 인간에서 고혈압, 혈전증, 혈관연축 및 죽상 경화증을 유발할 수 있다. 혈관에서의 NO 생성량은 eNOS 유전자에 의해 제어되는 eNOS 단백질의 발현 정도와 밀접한 상관 관계가 있을 수 있다. 그러므로 eNOS 다형성 변이 정도의 조사는 허혈성 심장 질환 및 뇌 혈관 질환과 같은 다양한 인간 혈관 질환과의 유전적 연관성을 밝힐 수 있다. eNOS 유전자의 다형성은 뇌졸중과 연관되어 고령인구 및 인종 간 비교를 토대로 이미 조사되었다. 비록 이러한 연구 중 일부는 상충되는 결과를 보고했지만, eNOS 다형성은 뇌졸중과 지속적으로 상관 관계를 보였다. eNOS 유전자는 염색체 7q35-36에 위치하며 21kb에 걸친 26개의 엑손으로 구성된다. 여러 eNOS 유전자 다형성 중 세 가지 유형이 뇌혈관 질환과의 연관성을 찾고자 조사되었다. 즉, 엑손 7의 Glu298Asp 다형성, 인트론 4의 다양한 탠덤 반복 횟수[VNTR, 27 bp 반복]의 다형성, 그리고 eNOS의 5'-측부 영역(flanking region)에 위치한 T-786C 다형성이다.

분만 중 신생아에서 가장 흔하게 확인되는 주산기 저산소성 허혈성 뇌병증(HIE) 은 중증의 장기적인 신경학적 결함의 중요한 원인이다. 주산기 저산소성 허혈성 뇌병증(HIE) 에서의 뇌혈류 저하는 입증되었으며 NO의 활성과 연관이 있다. 내피에 의한 NO 생성 증가는 뇌혈관 확장으로 이어지며 이로 인해 뇌혈류가 증가하여 보호 효과를 낼 수 있다. 그러나, NO의 혈관 확장 효과로 인한 뇌혈류의 증가는 허혈성 삽화(episode) 동안 오히려 재관류 손상을 일으킬 수 있다. 또한 저산소증-허혈성 삽화 동안의 과도한 NO 생성은 과산화물과 반응한 뒤 강력한 유리기인 과산화질소(peroxynitrite)를 생성하여 지질 과산화를 활성화시키고 뉴런 손상을 유발한다. 주산기 HIE 환자에서 eNOS 다형성의 가변성은 신생아의 뇌에서의 eNOS 활성과 NO 생성 모두에 영향을 줄 수 있으며, 이는 주산기 HIE의 중증도로 나타나는 상이한 임상 결과를 초래할 수 있다.

▷재료 및 방법

○실험 주제

이 연구는 2002년부터 2004년까지 단국대학교 병원 신생아 중환자실 또는 신생아실에 입원한 중등도 내지 중증의 주산기 HIE를 가진 37명의 만삭아 또는 준 만삭아(HIE 군)와 주산기 문제가 없는 54명의 정상 만삭아(대조군)를 포함했다. 주산기 HIE를 가진 모든 영아는 주산기 질식의 진단 기준을 충족하였으며 주산기 질식과 관련된 급성 뇌병증을 나타냈다. Sarnat 분류에 따를 때, 모든 HIE 환아의 임상경과는 중등도 또는 중증에 해당하였다. HIE를 가진 영아의 재태 연령(gestational age)은 36주 이상, 5분 아프가점수는 7점 미만이었으며 혈액가스 검사는 산성(pH <7.2), 저산소성, 그리고/또는 고탄산성이었다. 주요 선천 기형, 자궁 내 만성 감염, 입증된 패혈증, 다태아분만, 과숙아에 해당하는 영아는 포함되지 않았다. 모든 영아는 서로 가족으로 연관되어 있지 않은 민족적으로 동일한 한국인이었다. 모든 영아의 부모로부터 사전 동의를 얻었다. 이 연구는 단국대학교병원 임상시험심사위원회에 의해 승인되었다.

○DNA 추출 및 유전자형 분석

말초 혈액 샘플을 채취한 뒤 EDTA 튜브에 담았다. 혈액 내 백혈구로부터 게놈 DNA를 추출하였다. eNOS 유전자의 임상적으로 관련된 3가지 다형성은 모든 영아에서 앞에 기술한 것과 같이 확인되었다. 엑손 7의 Glu298Asp의 유전자형 분석은 한 조를 이루는 정방향 및 역방향 프라이머(각각 5'-AAG GCA GGA GAC AGT GGA TGG A-3' 그리고 5'-CCC AGT CAA TCC CTT TGG TGC TCA-3')를 사용한 PCR 증폭을 통해 밝혀졌다. 증폭된 258-bp 조각을 제한 효소인 BanII로 분해하여, 조각이 2개(163bp 및 85bp 단편)로 소화된 경우 "G" 야생형 대립 유전자로, 소화되지 않은 경우 변이 대립 유전자 "A"로 판별하였다. 이 조각들은 12% 아크릴아미드 겔 전기 영동으로 분석한 뒤 은 염색으로 시각화하였다. eNOS의 5'-측부영역에서 T-786C 다형성을 검출하기 위해 정방향 및 역방향 프라이머(각각 5'-TGG AGA GTG CTG GTG TAC CCC A-3' 그리고 5'-GCC TCC ACC CCC ACC CTG TC-3')를 사용하여 PCR을 시행하였다. 증폭된 생성물을 MspI로 분해하여, 140bp 그리고 40bp의 단편을 생성한 경우 야생형 대립 유전자(대립 유전자 "T")로, 90, 50 그리고 40bp의 단편을 생성한 경우 변이체(대립 유전자 "C")로 정의하였다. 이 조각들은 12% 아크릴아미드 겔 전기 영동으로 분리된 뒤 은 염색으로 시각화하였다. 인트론 4에서 VNTR 다형성의 검출은 정방향 및 역방향 프라이머(각각 5'-AGG CCC TAT GGT AGT GCC TTT-3' 그리고 5'-TCT CTT AGT GCT GTG GTC AC-3')를 이용한 PCR을 시행한 뒤 PCR 생성물을 2.5% 아가로스 겔 전기 영동으로 분리하고 브롬화에티듐 염색을 통해 시각화하였다. 420bp 길이의 야생형은 27bp 반복체 5개("b" 대립 유전자)를 포함했고, 393bp 변이형은 27bp 반복체 4개("a" 대립 유전자)를 포함하였다. eNOS 유전자의 3가지 다형성에 대한 유전자형 분석이 [그림 1]에 보여진다. VNTR의 유전자형 중 4aa 및 T-786C의 유전자형 중 CC는 본 연구에 포함된 영아에서는 검출되지 않았다.

○통계 분석

데이터는 Windows 용 SPSS 통계 패키지 프로그램 버전 14.0(미국 일리노이주 시카고, SPSS Inc)을 사용하여 분석하였다. 유전자형의 관찰된 빈도는 카이제곱 검정을 통하여 하디-와인버그 평형 하에서 예상되는 유전자형 빈도와 비교하였다. 그룹 간의 유전자형, 대립 유전자 및 하플로타입 빈도의 차이는 필요에 따라 카이제곱 검정, 스튜던트 t-검정, 또는 피셔의 정확도 검정으로 평가하였다. 0.05 이하의 p값을 유의하다고 보았으며, 특정한 경우 이를 검사한 대립 유전자의 수로 곱하여 보정하였다(Pcorr). 각 통계치의 교차비(odds ratio, 이하 OR) 및 95% 신뢰구간(confidence interval, 이하 CI) 또한 결정하였다.

▷결과

본 연구의 대상이 된 영아의 임상적 특성은 [표 1]에 나와 있다. 평균 출생체중과 재태연령은 HIE 군과 대조군 사이에 유의한 차이가 없었다. 1분과 5분 아프가점수는 대조군보다 HIE 군에서 유의미하게 낮았다(p<0.05). 다른 병원 또는 병원 외부에서 태어난 HIE 영아의 수는 21명(56.8%)이었으나 대조군에서는 없었다. 제왕 절개술은 HIE 군에서 22명(59.5%)에서 행해졌으며 대조군에서는 15명(27.8%)에서 행해졌다(p<0.05). 출생 시 질식과 관련된 태변 착색 및 태아 절박가사는 HIE 군에서만 관찰되었다.

eNOS 유전자에서 조사된 3가지 다형성의 유전자형과 대립 유전자의 빈도는 [표 2]에 나와 있다. 각 군에서 다형성의 유전자형 빈도는 하디-와인버그 평형과 일치하였다. 3가지 다형성과 관련된 유전자형의 분포는 대조군과 HIE 군 간에 유의한 차이가 없었다. 대립 유전자의 빈도 분석에서, Glu298Asp의 G 대립 유전자는 대조군보다 HIE 군에서 더 빈번했다(pcorr=0.036). HIE 군에서 G 대립 유전자의 OR은 8.28(95% CI, 1.05-65.57) 이었다. 대조군과 비교했을 때 HIE 합병증 아군에서는 T-786C의 TC 유전자형과 C 대립 유전자가 신생아 폐고혈압 지속증(persistent pulmonary hypertension of newborn, 이하 PPHN)인 아이에서 더 자주 관찰되었다(P=0.001, pcorr=0.002). PPHN에 관해서 TC 유전자형과 C 대립 유전자의 OR은 각각 24.00(95% CI, 2.14-269.11), 10.20(95% CI, 1.96-53.18)이었다.

eNOS 다형성의 8 가지 하플로타입 중 5% 이상의 빈도를 지닌 5개의 하플로타입을 [표 3]에 제시하였다. 하플로타입 빈도의 비교는 오직 대조군과 HIE 군 간에만 수행하였다. A b T 하플로타입의 빈도는 HIE 군에서 대조군보다 유의미하게 낮았다(p=0.029). HIE에 관한 A b T 하플로타입의 OR은 0.12(95% CI, 0.02-0.96)였다.

▷고찰

NO는 HIE, 기관지폐 이형성증, 심실 내 출혈, 조기 망막 병증(ROP), 그리고 괴사성 장염과 같은 주산기 사건과 관련된 여러 신생아 질환의 발병 기전에 중요한 역할을 한다. NO는 뇌혈류를 조절하여 뇌졸중 후 뇌 허혈의 정도를 조절하는 것으로 보여진다.

그러나 주산기 및 신생아 질환의 임상 증상과 eNOS의 상관 관계는 더 명확히 밝혀져야 한다. 최근 eNOS 27-bp 반복 다형성은 중증의 ROP의 위험성과 기능적 연관성을 갖는 것으로 제안되었다. 그러므로 eNOS 유전자의 분석은 HIE, 그리고 그 합병증과 연관된 중요한 유전적 다형성의 상관 관계에 대한 이해를 제공할 수 있다. eNOS 유전자에 대한 여러 연구에서 뇌혈관 질환과 관련된 임상 증상, 질병 경과, 합병증과의 강한 상관 관계를 보여주었다. 그러나 이전의 연구들은 엑손 7의 Glu298Asp 다형성과 허혈성 뇌혈관 질환의 상관 관계가 거의 없음을 보여주었다. 또한 일본의 연구에서 다른 연구팀은 인트론 4의 27 bp 반복 VNTR 다형성이 뇌혈관 질환의 위험 인자가 아님을 주장하였다. 그럼에도 엑손 7에서 Glu298Asp 다형성 중 G 대립 유전자의 동형접합(homozygocity)과 뇌경색, 특히 열공뇌경색(lacunar infarct) 사이의 연관성이 제안되었다. 뇌백질변성(leukoaraiosis)을 동반하지 않은 열공뇌경색에 대한 연구에서는 인트론 4에 위치한 VNTR 다형성과의 관련성을 보였다. 또한 eNOS 5'- 측부영역에서 T-786C 다형성은 허혈성 뇌졸중의 위험 인자로 간주되었다. 이전의 발견과 마찬가지로 본 연구에서는 엑손 7에 위치한 Glu298Asp의 G 대립 유전자와 주산기 HIE 간의 연관 가능성을 보였으나, 표본 크기가 작아 결과의 해석이 제한적이다. 주산기 HIE를 포함한 뇌혈관 질환에서 G 대립 유전자의 빈도는 HIE의 발병 기전에서 NO의 역할에 의해 설명될 수 있다. 그러므로 고령 인구에서의 뇌경색과 마찬가지로 G 대립 유전자는 주산기 HIE의 위험인자일 수 있으며, 주산기 HIE의 임상적 중증도는 eNOS 유전적 변이와 연관된 것으로 보인다.

활성은 혈관 확장성 폐적응(vasodilatory pulmonary adaptation)을 유지하는 데 중심적인 역할을 할 수 있다. 그러나 eNOS의 억제 또는 발현 감소는 PPHN과 유사한 질환을 초래할 수 있다. 그러므로 출생시의 폐혈관 확장성 적응 실패는 흔한 주산기 사건으로 폐동맥 수축을 자극한다. 폐혈관 수축으로 인한 폐고혈압은 동맥관(ductus arteriosus) 그리고/또는 타원공(foramen ovale)을 통해 발생하는 우좌단락(right-to-left shunt)과 더불어 PPHN의 주요 병리학적 소견이다. 그러므로 PPHN의 임상적 치료로 폐동맥의 선별적인 확장을 위해 대개 NO 흡입이 사용된다. eNOS 유적적 변이에 대한 이전의 연구에서 PPHN에서 eNOS 유전자 발현이 감소되었음을 보였다. 또한 PPHN을 지닌 영아의 내피세표에서 eNOS의 mRNA가 검출되지 않았다. 우리의 연구에서 T-786C의 TC 유전자형과 C 대립 유전자는 HIE의 합병증으로 발생하는 PPHN의 위험인자인 것으로 보인다. 그러나 본 연구에서 혈장 내 아질산염 및 질산염(NOx)의 농도, 그리고/또는 효소 활성도의 변화를 평가하지 않았기 때문에 T-786C의 TC 유전자형과 C 대립 유전자가 NO 생성 감소와 기능적 상관 관계를 가진다는 결론을 내기에는 한계가 있다. 몇몇 연구에서는 eNOS 유전자의 유전적 다형성과 NOx 수치의 상관 관계가 나타났다. 최근에 시행된 본태성 고혈압과 관련된 eNOS 변이체(variants) 및 4-좌위 하플로타입(4-locus haplotype)에 대한 연구에서는 대조군보다 환자군에서 통계적으로 유의한 NOx의 감소를 입증했다(p<0.0001). 또한 이 연구에서는 eNOS 변이체의 유무가 본태성 고혈압의 위험에 취약한 정도를 나타내는 표지자로 사용될 수 있음을 제안하였다.

본 연구는 eNOS 유전자의 엑손 7에 위치한 Glu298Asp의 G 대립 유전자와 주산기 HIE 사이의 관련성을 보여주는 첫 번째 연구이다. 또한, T-786C의 TC 유전자형과 C 대립 유전자는 HIE의 합병증의 하나인 PPHN과 연관되어 있다는 것이 관찰되었다. eNOS 다형성의 유전적 중요성을 확인하고 신생아 질환에서 eNOS의 유전적 영향을 평가하려면 더 많은 수의 PPHN을 지닌 HIE 환아에 대한 추가 조사가 필요하다.

▷출처: 조승국 대한의사협회 공보이사 '페이스북'